Wide Field Light-Sheet Microscopy with Lens-axicon Controlled Two-photon Bessel Beam Illumination

Sota Takanezawa, Takashi Saitou, Takeshi Imamura
Nat Commun. 2021 May 20;12(1):2979. doi: 10.1038/s41467-021-23249-y.
PMID: 34016994　PMCID: PMC8137944　DOI:10.1038/s41467-021-23249-y

この論文では，近赤外光を利用した２光子励起現象の新たな利活用によって，(1) 観察対象への低い光毒性，(2) 広い視野範囲，(3) 高い空間分解能，の3条件の向上を達成する光シート蛍光顕微鏡を開発しました．２光子励起顕微鏡は，生体に優しい蛍光イメージングを行うための装置です．しかしながら，２光子励起を起こすためには狭い範囲に光を集中させる必要があるために励起範囲（光シート顕微鏡では“視野範囲”）が狭くなってしまうという特性があります．本論文ではこれを解決するため，レーザー集光範囲を光軸方向に伸長させる（励起範囲を広げる）ベッセルビーム形成を可能な限りシンプルにして，エネルギー損失を大きく抑制することを目指した光学ユニットを作製しました．このユニットを使うことで，分解能を2-3μm（10倍拡大率, 開口数0.3の対物レンズを利用した場合）に保ったまま，ビーム長を600-1000μmの範囲で変化させることができることを示しました．この光学ユニットを用いて視野性と解像度に優れた２光子励起光シート蛍光顕微鏡を構築し，小型魚類（メダカ）の胚発生の観察に応用したところ，メダカの成長を阻害することなく（低光毒性），メダカ全体に対して（広い視野範囲），その発生過程を細胞レベル（高分解能）で，３日に渡り観察することに成功しました．本技術により，多様な生物の成長過程をこれまでよりも長期間に渡って，細胞レベルの高分解能で，生きたまま観察することができるようになります．

This paper presents a new light-sheet microscopy which attains improvements in three-conditions, low phototoxicity, extended field of view, and high resolution, using two-photon excitation technique. Two-photon excitation can lower phototoxicity, but its narrow excitation range restricts its applications in light-sheet microscopy. To address this issue, we studied a simple optical unit, called a lens-axicon triplet composed of an axicon and two convex lenses, which generate longer extent Bessel beams. We showed that this unit stretches the beam length of 600–1000μm less than a 4μm width with a 10× NA0.3 illumination objective lens. We then constructed a two-photon excitation digital scanned light-sheet microscope using this unit, and showed it possesses ~2-3-μm axial resolution. As applications of bio-imaging, we analyzed the cellular dynamics over the whole body of medaka fish. We demonstrated long-term time-lapse observations over several days and high-speed recording with ~3mm3 volume per 4s of the embryos. Our system provides a simple and easy setup for light-sheet microscopy, thus it can be a useful tool to analyze a wide variety of living organisms.